GB/T 18932.4-2002 蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定方法 液相色谱法检测标准

　　1.范围
　　GB/T 18932的本部分规定了蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量液相色谱测定方法。
　　本部分适用于蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定。
　　本部分的方法检出限:土霉素、四环素、金霉素、强力霉素均为0.010mg/kg。
　　2.规范性引用文件
　　下列文件中的条款通过GB/T 18932的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的*新版本。凡是不注日期的引用文件,其*新版本适用于本部分。
　　GB/T 6379-1986 测试方法的精密度 通过实验室间试验确定标准测试方法的重复性和再现性(neq ISO 5725:1981)
　　GB/T 6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法(neq ISO 3696:1987)
　　3.原理
　　试样中四环素族抗生素残留用0.1mol/LNa2 EDTA-Mcllvaine(pH=4.0±0.05)缓冲溶液提取,经离心后,上清液用 Oasis hLB或相当的固相萃取柱和阴离子交换柱净化,紫外检测器高效液相色谱仪测定,外标法定量。
　　4.试剂和材料
　　除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682-1992规定的一级水。
　　4.1 甲醇:一级色谱纯。
　　4.2 乙腈:一级色谱纯。
　　4.3 乙酸乙酯:重蒸馏。
　　4.4 磷酸氢二钠(Na2HPO·2H2O):优级纯。
　　4.5 柠檬酸(C6H8O7·H2O)。
　　4.6 乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)。
　　4.7 草酸
　　4.8 磷酸氢二钠溶液:0.2mol/L。称取28.41g磷酸氢二钠(4,4),用水溶解,定容至1000mL。
　　4.9 柠檬酸溶液:0.1mo/L。称取21.01g柠檬酸(4.5),用水溶解,定容至1000mL。
　　4.10 Mcllvaine缓冲溶液:将1000mL0.lmol/L柠檬酸溶液(4.9)与625mL0.1mol/L磷酸氢二钠溶液(4.8)混合,必要时用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH=4.0±0.05。
　　4.11 Na2EDTA- Mcllvaine缓冲溶液:0.1mol/L。称取60.5g乙二胺四乙酸二钠(4.6)放入1625 mL Mcllvaine缓冲溶液(4.10)中,使其溶解,摇匀。
　　4.12 甲醇十水(1+19):量取5mL甲醇(4.1)与95mL水混合。
　　4.13 Oasis HLB固相萃取柱或相当者:500mg,6mL。使用前分别用5m甲醇和10mL水预处理,保持柱体湿润。
　　4.14 阴离子交换柱:羧酸型,500mg,3mL。使用前用5mL乙酸乙酯预处理,保持柱体湿润。
　　4.15 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质:纯度≥95%。
　　4.16 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准溶液:0.1mg/mL。准确称取适量的土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质(4.15),分别用甲醇配成0.1mg/mL的标准储备液。储备液贮存在-18℃。
　　根据需要用流动相逐级稀释成适当浓度的混合标准工作溶液,混合标准工作溶液在4℃保存,可使用3天。
　　5.仪器
　　5.1 高效液相色谱仪:配有紫外检测器。
　　5.2 分析天平:感量0.1mg,0.01g。
　　5.3 液体混匀器。
　　5.4 固相萃取真空装置。
　　5.5 贮液器:50mL。
　　5.6 微量注射器:25μL,100μL。
　　5.7 刻度样品管:5mL,精度为0.1mL。
　　5.8 真空泵:真空度应达到80kPa。
　　5.9 离心管:50mL。
　　5.10 平底烧瓶:100mL。
　　5.11 pH计测量精度±0.02。
　　6.试样的制备与保存
　　6.1 试样的制备
　　对无结晶的实验室样品,将其搅拌均匀。对有结晶的样品,在密闭情况下,置于不超过60℃的水浴中温热,振荡,待样品全部融化后搅匀,迅速冷却至室温。分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中,密封,并标明标记。
　　6.2 试样保存
　　将试样于常温下保存。
　　7.测定步骤
　　7.1 提取
　　称取6g试样,*到0.01g。置于150mL三角瓶中,加入30mNa2 EDTA-Mcllvalne缓冲溶液(4.11),于液体混匀器上快速混合1min,使试样完全溶解。样液倒入50mL离心管中,以3000r/min离心5min,待净化。
　　7.2 净化
　　将上清液(7.1)倒入下接 Oasis HLB柱或相当者(4.13)的贮液器中,上清液以≤3mL/min的流速通过Oass或相当的固相萃取柱,待上清液完全流出后,用5mL甲醇十水(4.12)洗柱,弃去全部流出液。在65kPa的负压下,减压抽干20min,*后用15mL乙酸乙酯(4.3)洗脱收集洗脱液于100mL圆底烧瓶中。
　　按上述方法使洗脱液(7.2)在减压情况下以≤3mL/min的流速通过阴离子交换柱(4.14),待洗脱液全部流出后，用5mL甲醇(4.1)洗柱，弃去全部流出液。在65kPa负压下，减压抽干5min，再用4mL流动相洗脱，收集洗脱液于5mL样品管中，定容至4mL，供液相色谱仪测定。