NY/T 2278-2012 灵芝产品中灵芝酸含量的测定 高效液相色谱法检测标准

　　1 范围
　　本标准规定了灵芝及其制品中灵芝酸A和灵芝酸B的高效液相色谱测定方法。
　　本标准适用于灵芝及其制品灵芝酸A和灵芝酸B的测定。
　　本标准灵芝酸A和灵芝酸B的定量测定范围均为30mg/kg~500mg/kg。
　　本标准灵芝酸A和灵芝酸B的检测限均为10mg/kg。
　　2 规范性引用文件
　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其*新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
　　3 原理
　　试样中灵芝酸A和灵芝酸B用甲醇超声提取，提取液经氮气吹干后甲醇溶解，高效液相色谱法测定，以保留时间进行定性，外标法定量。
　　4 试剂
　　除非另有规定，仅使用色谱纯试剂和符合GB/T 6682 中规定的一级水。
　　4.1 甲醇(CH3OH)。
　　4.2 甲酸(CH2O2)。
　　4.3 乙腈(CH3CN)。
　　4.4 0.1%甲酸水溶液：取1m甲酸(4.2)定容至1L。
　　4.5 灵芝酸A(CAS号81907-62-2)和灵芝酸B(CAS号81907-61-1)：纯度≥96%。
　　4.6 标准溶液：准确称取灵芝酸A(4.5)和灵芝酸B(4.5)标准品各10mg(*至0.1mg)，用甲醇定容至10mL。该混合标准液中灵芝酸A和灵芝酸B的质量浓度均为1000μg/m，-18℃冰箱保存，有效期3个月。
　　5 仪器和设备
　　5.1 高效液相色谱仪，配紫外检测器或二*管阵列检测器。
　　5.2 超声波清洗器，功率大于450W，频率50Hz~100Hz。
　　5.3 分析天平，感量0.01g和感量0.0001g。
　　5.4 有机系滤膜，0.45μm。
　　5.5 样品粉碎机。
　　5.6 氮气吹干仪。
　　6 分析步骤
　　6.1 试样制备
　　取不少于200g具代表性灵芝子实体，用样品粉碎机(5.5)粉碎(超细粉等无需粉碎)，将样品装于密封容器中，制成待测样，0℃~20℃保存备用。
　　6.2 试样提取
　　称取粉碎均匀的试样0.5g(*至0.001g)于50mL离心管中，加甲醇(4.1)25mL摇匀，置于超声波清洗器(5.2)中超声提取30min，提取液经滤纸过滤，取滤液5mL置于10mL刻度试管中，于50℃左右氮气吹干，残留物用1.0mL甲醇(4.1)溶解，过滤膜(5.4)，供高效液相色谱仪分析。
　　6.3 测定
　　6.3.1 色谱参考条件
　　色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm(i.d.)，5μm，或相当规格色谱柱。
　　流动相：乙腈(4.3)+0.1%甲酸水溶液(4.4)=30+70
　　流速：1.0mL/min。
　　柱温：40℃。
　　波长：258nm。
　　进样量：20μL。
　　6.3.2 标准曲线
　　准确吸取适量混合标准溶液(4.6)用甲醇稀释，配制质量浓度为1.00μg/mL、2.00μg/mL、5.00μg/mL、10.0μg/m、20.0μg/mL和50.0μg/mL的标准工作液，按参考色谱条件测定，以灵芝酸A和灵芝酸B的质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线或计算线性回归方程。标准品色谱图参见图A.1。
　　6.3.3 测定
　　按照保留时间进行定性，样品与标准品保留时间的相对偏差不大于2%，单点或多点校正外标法定量。待测样液中灵芝酸A和灵芝酸B的响应值应在标准曲线范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。同时做空白试验。
　　7 结果计算
　　试样中灵芝酸A和灵芝酸B的量以质量分数a计，单位以毫克每千克(mg/kg)表示，按式(1)计算。
　　w=A*p*V/（As*m）*f
　　式中：
　　A——试样中灵芝酸A或灵芝酸B的峰面积；
　　As——标准工作液中灵芝酸A或灵芝酸B的峰面积；
　　p——标准工作液中灵芝酸A或灵芝酸B的质量浓度，单位为微克每毫升(pg/mL)；
　　V——试样液*终定容体积，单位为毫升(mL)；
　　m——试样的质量，单位为克(g)；
　　f——样品稀释倍数。
　　以两次平行测定值得算数平均值作为测定结果，计算结果保留三位有效数字。
　　8 精密度
　　8.1 重复性
　　在重复性条件下获得的两次独立测试结果的*差值不大于这两个测定值的算术平均值的5%。