GB/T 19524.1-2004 肥料中粪大肠菌群检测标准

　　1 范围
　　本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法
　　2 定义
　　下列定义适用于本标准
　　粪大肠菌群 fecal coliforms
　　群在44.5℃±0.5℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌
　　粪大肠菌群数为每克(毫升)肥料样品中粪大肠菌群的*可能数(MPN)。
　　3 仪器设备
　　高压蒸汽灭菌器;显微镜;恒温水浴或隔水式培养箱;恒温旋转式摇床;干燥箱;天平;酸度计或精密pH试纸;接种环;试管(15mm×150mm);小套管(杜兰管);移液管、三角瓶、培养皿、载玻片、玻璃珠酒精灯、试管架。
　　4 培养基和试剂
　　4.1 培养基:遵照附录A的规定
　　4.2 革兰氏染色液:遵照附录B的规定
　　5 检验步骤
　　样品稀释
　　在无菌操作下称取样品10.0g或吸取样品10mL,加入到带玻璃珠的90mL无菌水中,置于摇床200r/min充分振荡30min,即成0.1稀释液
　　用无菌移液管吸取5.0ml上述稀释液加入到45mL无菌水中,混匀成0.01稀释液。这样依次稀释,分别得到0.001,0.0001等浓度稀释液(每个稀释度须更换无菌移液管)
　　5.2 乳糖发酵试验
　　选取三个连续适宜稀释液,分别吸取不同稀释液1.0mL加入到乳糖胆盐发酵管内,每一稀释度接种3支发酵管,置44.5℃士0.5℃恒温水浴或隔水式培养箱内,培养24h±2h。如果所有乳糖胆盐发酵
　　管都不产酸不产气,则为粪大肠菌群阴性;如果有产酸产气或只产酸的发酵管,则按5.3进行
　　5.3 分离培养
　　从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线,置36℃±1℃条件下培养18h~24h
　　5.4 证实试验
　　从5.3分离平板上挑取可疑菌落,进行革兰氏染色。染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性;如果为革兰氏阴性无芽胞杄菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中,置4.5℃±0.5℃条件下培养24h±2h观察产气情况,不产气为粪大肠菌群阴性;产气为粪大肠菌群阳性
　　5 结果
　　证实试验为粪大肠菌群阳性的,根据粪大肠菌群阳性发酵管数,查MPN检索表,得出每克(毫升)料样品中的粪大肠菌群数
　　GB/T19524.1—2004 附录A(规范性附录)
　　培养基
　　A.1 乳糖胆盐发酵培养基
　　蛋白胨 20.0g
　　猪胆盐 5.0g
　　乳糖 10.0g
　　0.004%溴甲酚紫水溶液 25.0mL
　　蒸馏水 1000mL
　　PH值 7.2~7.4
　　制法:将蛋白胨猪胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中,校正pH,加入溴甲酚紫水溶液,然后分装试管,每管9mL,并放入一支倒置的小套管,高压灭菌115℃、15min。
　　注1:初发酵培养基
　　注2:粪大肠菌群细菌发酵乳糖产酸产气使培养液由紫色变成黄色,套管内充有气体
　　A.2 伊红美蓝琼脂培养基
　　磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O) 2.0g
　　琼脂 20.0g
　　2%伊红Y水溶液 20.0mL
　　0.65%美蓝水溶液 10.0mL
　　pH值 7.2~7.4
　　制法:将蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾溶解于蒸馏水中,校正pH,投入琼脂并加热溶解,分装于三角瓶中,高压灭菌115℃、15min备用。伊红和美蓝溶液分别高压灭菌121℃、20min。临用时加热熔化培养基,冷却至50℃~55℃,加入无菌的伊红和美蓝溶液,播匀倾注平板。
　　A.3 乳糖发酵培养基
　　制法:将蛋白胨及乳糖溶于水中,校正pH,加入指示剂,按检验要求分装3mL~5mL,并放入1支倒置的小套管,高压灭菌115℃、15min。